Sản xuất chế phẩm diệt sâu khoang Spodoptera litura từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia Marcescens SH1
Giá
Liên hệ
- Xuất xứ
Prodigiosin trích ly từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH1 đã được chứng minh là có khả năng diệt sâu khoang Spodoptera litura và sâu xanh da láng Spodoptera exigua. Nghiên cứu này nhằm phát triển chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin. Để đạt mục tiêu đó, dịch nuôi cấy S. marcescens SH1 được điều chỉnh về pH2 bằng HCl 1N trong 4 giờ tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn mà không ảnh hưởng lên nồng độ prodigiosin, còn giữ được hoạt tính enzyme protease và lipase. Dịch nuôi cấy sau xử lý acid có khả năng ức chế tăng trưởng nấm Fusarium sp. là 53,19% và vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli và Staphylococcus aureus. Chế phẩm sinh học được tạo thành từ dịch nuôi cấy xử lý acid thể hiện hiệu lực diệt sâu khoang tuổi 3 là 56,20% chỉ sau 48 giờ và hoàn toàn 100% sau 96 giờ, với liều lượng prodigiosin là 16,5 ng/cm2 tương đương với thuốc trừ sâu sinh học REASGANT 1.8EC. Chế phẩm sinh học trừ sâu có thể bảo quản tốt ở nhiệt độ là4oC và nên tránh ánh sáng trực tiếp từ mặt trời.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Vi khuẩn Serratia marcessens – SH1 được phân lập từ tuyến trùng Heterorhabditis indica CP 16 (H – CP16). Vi khuẩn chỉ thị Escherichia coli, Staphylococcus aureus do phòng thí nghiệm HUTECH cung cấp. Nấm bệnh Fusarium sp, Collectotrichum sp. do TS. Nguyễn Thị Hai cung cấp. Sâu khoang Spodoptera litura được bắt ruộng rau đắng tại huyện Cần Giờ, Tp.HCM và nhân nuôi trong môi trường nhân tạo với thức ăn là lá thầu dầu.
Tăng sinh khối vi khuẩn S. marcescens SH1
Vi khuẩn tăng sinh 48 giờ, nhiệt độ phòng trong 300 ml môi trường peptone glycerol broth (PGB) đã tiệt trùng, tỉ lệ cấy giống 1%, lắc 150 vòng/phút.
Xác định nồng độ prodigiosin
Đo trực tiếp OD499nm mẫu chứa prodigiosin khi dung môilà nước và tính giá trị hiệu chỉnh tính đến độ pha loãng (Mekhael và Yuosif, 2009), hoặc trích ly prodigiosin từ tế bào bằng ethanol: HCl 1N (95:5) và đo OD535nm, sửdụng đường chuẩn tính về nồng độ prodigiosin (Nguyễn Hoài Hương và Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2015).
Xử lý dịch nuôi cấy
Xử lí acid
Sử dụng dung dịch acid HCl 1N điều chỉnh dịch nuôi cấy S. marcescens SH1 về pH1 hoặc pH2, lắc 150 vòng /phút. Sau 2, 4, và 24 giờ, điều chỉnh pH dịch nuôi cấy về pH7 bằng NaOH 1N. Xác định mật độ prodigiosin trong dịch nuôi cấy trước và sau khi xử lý acid bằng cách đo OD499nm. Mật độ vi khuẩn sống sót được xác định bằng cách thời cấy trang vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng 100, 10-1 và 10-2, ủ đĩa trong tối 24 giờ và đọc kết quả.
Xử lí nhiệt
Dịch nuôi cấy thu được sau khi tăng sinh như trên được xử lý nhiệt độ 50oC, 65oC và 80oC 15 phút. Dịch nuôi cấy sau xử lý nhiệt được cấy trang lên thạch peptone glycerol agar PGA ở các nồng độ pha loãng 100,10-1 và 10-2. ủ đĩa trong tối 24 giờ và đọc kết quả.
Đồng thời trích ly dịch nuôi cấy ở mỗi nhiệt độ xử lí bằng ethanol/HCl 1N (95:5), đo OD 535nm nhằm xác định nồng độ prodigiosin trong dịch nuôi cấy.
Khảo sát hoạt tính dịch nuôi cấy
Hoạt tính enzyme
Hoạt tính lipase, protease, chitinase được bán định lượng bằng phương pháp khuếch tán trong giếng thạch.Thạch lipid (Tween 20 1%), thạch casein 1% và thạch huyền phù chitin 1% được đục lỗ và nhỏ dịch nuôi cấy trước và sau khi xử lý acid và trung hòa về pH7, để 24 giờ ở nhiệt độ phòng, đo đường kính vòng phân giải.
Khả năng kháng khuẩn
Vi khuẩn chỉ thị tăng sinh trong môi trường TSB, lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, 24 giờ, điều chỉnh mật mật độ tế bào về 106 cfu/ml. Dịch nuôi cấy S. marcescens SH1 xử lý acid và trung hòa về pH7 được pha loãng 2, 4, 8, 16 và 32 lần, đo OD499nm ở mỗi nồng độ pha loãng và khỏa sát khả năng kháng khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán trong giếng thạch môi trường NA. Ủ 24 giờ 37oC, đo đường kính vòng kháng khuẩn.
Khả năng kháng nấm
Tương tự như trên, sử dụng phương pháp đục giếng thạch để quan sát sự ức chế của đường kính phát triển của nấm bệnh chỉ thị. Xác định tỉ lệ ức chế theo công thức Panday và cộng sự (1982).
Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp nhỏ giọt trên bề mặt lá
Nuôi sâu trong phòng nhiệt độ 25 ± 2oC, ẩm độ 70 ± 5% trên lá thầu dầu.
Mỗi hộp thí nghiệm chứa 30 sâu tuổi 3 và 3 lá thầu dầu (diện tích tổng là 1500 cm2) được quét lên bề mặt mỗi lá 100 μl dịch nuôi cấy xử lý acid đã đưa về pH 7 ở nồng độ pha loãng 10-0, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 và 10-5. Đối chứng âm thay dịch nuôi cấy bằng môi trường PGB xử lý acid và trung hòa tương tự mẫu thí nghiệm. Đối chứng dương là chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học REASGANT
1.8EC với liều sử dụng như hướng dẫn là 6 ng/cm2.
Để khảo sát ảnh hưởng phụ gia tạo chế phẩm thí nghiệm lặp lại như trên, dịch nuôi cấy xử lý acid trung hòa tại mỗi nồng độ pha loãng được bổ sung Tween 80 0,02 %, rỉ đường 1% và CMC 1%.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và theo dõi sâu chết theo thời gian đến khi hộp đối chứng chuyển sang nhộng.Hiệu lực diệt sâu tính theo công thức Abbott (Abbot, 1925).
Khảo sát thời gian bảo quản dịch nuôi cấy sau xử lí
Dịch nuôi cấy vikhuẩn S. marcescens SH1 đã được xử lí acid và trung hòa về pH7 và được bảo quản trong tối và ngoài sáng ở 4oC, nhiệt độ phòng và nhiệt độ ngoài trời, đo OD499tại mỗi điều kiện sau 24 giờ, theo dõi trong vòng 7 ngày.
Khảo sát điều kiện và thời gian bảo quản chế phẩm
Chế phẩm được bảo quản trong 7 ngày ở điều kiện như trên. Trích ly prodigiosin từ chế phẩm bằng phương pháp trích ly lỏng - lỏng theo Nguyễn Hoài Hương và Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2015, đo OD535nm để xác định nồng độ prodigiosin.
Xử lý số liệu
Thí ngiệm lập lại ba lần. Phân tích ANOVA bằng phần mềm SAS.
KẾT QUẢ
Kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng sản xuất chế phẩm diệt sâu chứa prodigiosin từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH1 xử lý acid pH2 trong 4 giờ, bổ sung rỉ đường, CMC và Tween 80 với nồng độ thích hợp tạo chế phẩm còn 80 % hoạt chất sau 7 ngày ở nhiệt độ ngoài trời có chiếu sang và > 90% hoạt chất nếu bảo quản 4 độ C trong tối.